一、CLIP-seq数据分析方案流程
二、CLIP-seq数据质量分析
Clean reads碱基质量分析
方法描述：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，碱基质量（Q）与测序错误率（P）密切相关，受测序仪状态，测序试剂质量，样本特性等的影响。质量值计算公式如下：
结果展示
GC含量分析
方法描述：对测序reads中四种碱基的分布比例进行评估。
有效长度统计
方法描述：去掉index序列、建库平衡用随机碱基及截取掉后面低质量的碱基后，我们用获得的clean reads进行有效长度分析。
cDNA库的代表性分析
方法描述：如果PCR扩增过度，文库中会含有大量序列完全相同的reads。为了保证文库更好代表原始DNA的丰度，本公司在建库中对PCR扩增循环有严格控制。 PCR duplication level计算方法为：从测序数据中随机挑选20万reads作为Total Reads，按照如下公式进行计算：
三、CLIP-seq结果展示
Reads比对到参考基因组结果
方法描述：在这部分分析中，我们将有效测序数据（clean reads）比对到参考基因组上
Reads在基因组不同区域的分布情况
方法描述：将clean reads比对到参考基因组上，统计各个区域的分布情况，统计结果如下：
基因组的覆盖度和特征分析
方法描述：CLIP-seq reads随转录单元长度的覆盖强度分析，以距转录起始位点和转录终止位点为标准，把cDNA平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中的reads平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度
方法描述：CLIP-seq reads随转录单元长度的覆盖强度分析，将基因的5’UTR, CDS, 3’UTR各平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中的reads 平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度。
reads在转录起始位点，转录终止位点，起始密码子和终止密码子附近的分布
方法描述：分别以转录起始位点/转录终止位点，翻译起始密码子/终止密码子为原点，统计其上下游1kb范围内reads的分布情况。
样本相关性分析
方法描述：统计落在每个gene上的reads数目，计算每个gene的RPKM值，然后通过比较同一个gene在两个样本中的RPKM值得到两个样本间的相关性。IP项目中，如果实验与对照样本间相关性系数高，则说明两个样本中大部分reads在染色体上的分布情况类似，暗示实验样本结合的RNA/DNA的富集程度和特异性较低。
样本聚类分析
方法描述：在这部分分析中，根据样本相关性系数进行样本间聚类分析。
结合峰分析
结合峰分析策略
方法描述：因为每个基因的表达量不同，定位在基因组一个位置上的CLIP-seq序列的多少无法评估该RNA结合蛋白在该位置上是否特异性结合。如何剔除基因表达量对RNA结合蛋白特异性结合信号带来的噪音，是分析CLIP-seq数据的一个关键点。MIT的Phillip A Sharp（因发现基因剪接获得过诺贝尔奖获）实验室2009年一篇论文利用exon array转录本丰度作为参考，来消除表达量对AGO2蛋白所特异结合的mRNA位点的干扰(Chi, Zang et al. 2009)。理论依据是：转录本丰度低的mRNA在IP过程中被RNA结合蛋白抓下来的几率小，反之亦然。
方法一：ABLIRC
我们要求用于分析的单位置比对序列（unique mapped read）彼此之间需要互相重叠，重叠区域至少为1nt。对选定的基因，根据定位到此基因的reads产生随机序列，对此基因进行模拟定位500次，找出500次中最大的随机序列高度(p-value<0.01)作为背景，如果此基因中最大的peak高度<最大的随机序列高度，则认为该peak为noise，将其去除；反之，则将该peak保留为结合峰。
方法二：Piranha
方法描述：根据测序深度和覆盖度选取某一固定长度（xx nt）为单位（bin）将基因组等分，统计每个bin中的reads数目。模拟数据中reads的分布情况，来作为背景噪音，然后基于zero truncated negative binomial (ZTNB) 来寻找reads分布显著高于背景的位置。在此过程中每个bin都会获得一个p-value，根据p-value进行显著性筛选，得到真实的结合峰(Uren, Bahrami-Samani et al. 2012)。
结合峰统计
方法描述：本项目使用上述策略，以input样本为背景，对实验样本的rmdup reads进行Peak Calling，得到实验样本特异的结合峰（peak）并进行统计，结果如下：
结合峰宽度统计
方法描述：对实验样本特异的结合峰的宽度进行统计，得到结果如下：
结合峰在参考基因组上的分布
方法描述：统计结合峰在参考基因组上各个区域的分布情况，统计结果如下：
结合峰重叠分析
方法描述：维恩图主要展示两次重复实验之间重叠的peak的数目。
结合基序分析
方法描述：我们用HOMER (Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment)对实验样本特异的结合峰进行motif分析。
结合峰相关基因聚类Gene Ontology 富集分析
方法描述：
1. 利用blast将参考基因组的基因序列比对到Gene Ontology数据库，进行GO注释；
2. 提取比对结果，作为背景即background；
3. 根据结合峰相关基因（peak associated gene）注释信息，统计每个基因所在的GO Term，根据每个Term的基因数目，以及背景中此Term的基因数目，用超几何分布检验分析每个Term的显著性。
4. 选取排名前10的GO Term及其校正p-value和百分比图进行展示。
结合峰相关基因KEGG Pathway富集分析
方法描述：
1. 利用blast将参考基因组的基因序列比对到KEGG数据库，进行KEGG注释；
2. 提取比对结果，作为背景即background；
3. 根据结合峰相关基因（peak associated gene）注释信息，统计每个基因所在的KEGG pathway，根据每个pathway的基因数目，以及背景中此pathway的基因数目，用超几何分布检验分析每个pathway的显著性。
4. 选取排名前10的pathway及其校正p-value和百分比图进行展示。
