Reads在转录起始位点，转录终止位点，起始密码子和终止密码子附近的分布
Regulation of Poly(A) Tail and Translation during the Somatic Cell Cycle
V. Narry Kim实验室于2014年开发了可用于高通量检测Poly(A)尾巴长度的TAIL-seq技术，并发现在胚胎细胞以外Poly(A)尾巴长度和翻译效率并无明显的线性相关关系。现在该实验室的研究者们利用TAIL-seq和核糖体分析（ribosome profiling）技术，分析细胞周期中Poly(A)尾巴长度和翻译调控的关系。
一、PolyA-seq数据分析流程
二、PolyA-seq数据质量分析
Clean reads数据质量分析
方法描述：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，碱基质量（Q）与测序错误率（P）密切相关，受测序仪状态，测序试剂质量，样本特性等的影响。质量值计算公式如下：
结果展示
GC含量分析
方法描述：对测序reads中四种碱基的分布比例进行评估，检查是否存在AT、CG分离现象，理论上A与T、C与G的含量在整个测序反应中分别相同，且维持 在稳定水平。
有效长度统计
方法描述：去掉index序列、建库平衡用随机碱基及截取掉后面低质量的碱基后，我们用获得的clean reads进行有效长度分析。
reads冗余度统计
在cDNA文库构建的过程中对捕获的mRNA/ncRNA 进行随机片段化，随后加接头并进行RT-PCR。一个多样性的文库中大多数序列应该只出现一次，低水平的序列冗余度往往表明高水平的靶标序列覆盖度，而高水平的序列冗余度则意味着一定程度上的偏好富集性，如文库构建过程中PCR过度扩增。通常测序深度越高，越容易产生一定程度的重复reads，属于正常的现象。实际操作中，由于数据量较大，为了降低计算中对内存的要求，仅选取了每个文件的前200,000条reads进行分析，认为其可以代表全部序列的冗余度。
PCR duplication level计算方法为：从测序数据中随机挑选20万reads作为Total Reads，按照如下公式进行计算：PCR duplication level=Duplication Reads/Total Reads
三、PolyA-seq结果展示
全基因组定位分析
Reads比对到参考基因组结果
方法描述：根据不同的基因组的特征，选取相对合适的软件，动植物用HISAT2 (Kim D, Langmead B et al. 2015)、真菌或者基因密度较高的物种用Bowtie2(Langmead and Salzberg 2012)，根据需要会设定一定的容错率，将有效测序数据（clean reads）比对到参考基因组上。
Reads在基因组不同区域的分布情况
方法描述：统计在基因组上有唯一定位的reads在各个区域的分布情况
Reads在基因组的覆盖率和特征分析
方法描述：reads随转录单元长度的覆盖强度分析，以距转录起始位点和转录终止位点为标准，把cDNA平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中reads平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度
Reads在转录起始位点，转录终止位点，起始密码子和终止密码子附近的分布
方法描述：分别以转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TTS）为原点，统计其上下游1kb范围内reads的分布情况，结果如下：
方法描述：分别以起始密码子（start codon）和终止密码子（stop codon）为原点，统计其上下游1kb范围内reads的分布情况，结果如下：
基因检出
方法描述：RPKM (Reads per kilo base of a gene per million reads)，表示每百万 reads 中来自于某基因每千碱基长度的 reads 数，表征基因的表达丰度(Mortazavi, Williams et al. 2008)。通过对mRNA长度和测序深度进行均一化(RPKM)，使不同测序样本之间的表达丰度具有可比性，消除了因mRNA长度和不同样本之间测序深度差异可能导致的偏差，RPKM计算公式：RPKM=total exon reads/(uniquely mapped reads*exon length)
Poly(A)spke-in长度分析
方法描述：在文库构建中，加入了用于对照的长度为120nt和40nt的poly(A) tail spike-in序列，统计测序数据中检出的spike-in序列中poly(A)的长度分布，结果如下：
统计reads中poly(A)长度的分布
方法描述：对每个样本中含有不同长度poly(A)的polyA_clean_reads的数目进行统计，结果如下：
Poly(A)reads长度中位数
方法描述：对每个样本中的polyA_clean_reads，将截掉A之后剩余部分的reads比对到参考基因组上，统计比对上的这些reads所在基因的poly(A)长度的中位数，然后得到每个样本中具有不同poly(A)长度中位数的基因的数目，分布如下：
Poly(A)长度差异分析
方法描述：对于不同处理的样本，使用秩和检验（Rakumtet）分析poly(A)长度的中位数的差异情况，筛选poly(A)长度中位数变化显著（满足p-value <=0.01）的基因，并根据poly(A)长度中位数差异的绝对值的不同范围，分成1-10nt，11-20nt，21-30nt及30nt以上等组，进一步统计不同poly(A)长度变化范围的基因数目。
Poly(A)长度差异基因的Gene Ontology 富集分析
Poly(A)长度差异基因的KEGG Pathway富集分析
