DNA甲基化修饰技术简介
DNA甲基化是一种在DNA核苷酸胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)上加上甲基的生化过程。DNA甲基转移酶(DNMT)通过向第五个碳原子添加甲基将未修饰的胞嘧啶(C)转化为5-甲基胞嘧啶(5mC)。TET酶将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。DNA甲基化可以在细胞从胚胎干细胞分裂和分化成特定组织的过程中稳定地改变细胞中基因的表达。这一过程通常是永久和单向的，从而阻止细胞退分化为干细胞或者变成其他种类的细胞。DNA甲基化同时也是染色质结构形成的基础，在几乎所有种类的癌症发展中都扮演者非常重要的角色。DNA甲基化是最初被发现的表观遗传标记，直到现在仍是研究最多的表观遗传标记。在动物中，DNA甲基化主要包括CpG岛的胞嘧啶(C)的C-5位置的甲基化，然后导致转录活性的抑制。
BS-seq简介及原理
重亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing，BS-seq，也称为Bisulfite-seq或Methyl-Seq），是一种利用亚硫酸盐处理DNA，在全基因组范围内以单碱基分辨率研究胞嘧啶的甲基化状态的方法。BS-seq其原理在于，亚硫酸盐可使DNA上的胞嘧啶(C)转变成为尿嘧啶(U)，同时已被甲基化的5-甲基胞嘧啶则不受影响。如此一来，通过亚硫酸盐处理可以使研究人员获得DNA序列上的特定碱基改变，从而确定其甲基化的情形。在获得亚硫酸盐处理后的DNA序列信息后，许多分析方法可以通过读取序列信息并进行基因组比对，来获得DNA甲基化的信息，这类分析的目标在于区分由亚硫酸盐处理导致的单核苷酸多态性（胞嘧啶和胸腺嘧啶），以此来判断基因组DNA甲基化情况，并和生物学意义进行关联。
亚硫酸测序的优点使其能够应用于基因组尺度的分析，然而在此之前，总体测量DNA甲基化仅能通过其他技术手段实现，如限制性标记基因组扫描(Urich et al. 2015)。在人类基因组计划完成后，许多科学家随后绘制出了人类表观组图谱，这一表观遗传信息的获得将对遗传序列执行和调控功能的理解十分重要，表观组比基因组相对不稳定，因此表观组被认为在基因-环境互作中起重要作用(Schübeler 2015; Law & Holland 2019)。
产品优势
1、针对不同研究领域提供个性化方案；
2、分析流程全备，数据解读详细，后期数据挖掘可提供个性化分析；
3、研究思路丰富：发育过程中DNA甲基化修饰图谱及修饰位点变化；疾病和对照组甲基化修饰图谱及修饰位点差异；与ChIP-seq、RNA-seq等数据一起联合使用，揭示甲基化修饰位点的功能。
BS-seq适应样本类型及样品要求
样本类型：细胞、组织或DNA；
样本要求：DNA，大于100 ng；细胞干体积大于1000μl；组织样本大于或等于100mg；
样品运输及保存：DNA溶解在TEbuffer或EBbuffer；细胞样品或新鲜组织块转入1.5mL的EP管中用液氮速冻，后置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。
BS-seq的应该场景及分析思路
1. 应该场景：发育、疾病等生物学各方向；
2. 研究思路：发育过程中DNA甲基化修饰图谱及修饰位点变化；疾病和对照组甲基化修饰图谱及修饰位点差异；与CHIP-seq、RNA-seq等数据一起联合使用，揭示甲基化修饰位点的功能。
BS-seq的应用案例
案例一——通过对正常肾脏组织和肾脏肿瘤组织进行BS-seq，分析发现，与匹配的正常组织相比，肾脏肿瘤中没有发生全基因组范围5mC丢失，而5hmC在几乎所有肾脏肿瘤组织中全范围丢失。肿瘤组织中的5hmC水平是肾癌的独立预后标志，5hmC水平越低总生存期越短。肿瘤中5hmC的丢失与高甲基化有关，特别是在基因区域。研究结果表明，5hmC缺失通过重构DNA甲基化模式，既是一种预后标志物，也是肾癌的致癌事件(Chen et al. 2016)。
案例二——拟南芥新生DNA甲基转移酶DRM2 (DOMAINS rearrange METHYLTRANSFERASE 2)对维持DNA甲基化稳态、确保基因组完整性至关重要，而为COP9 interaction F-BOX KELCH 1(CFK1)的，可通过泛素-26s蛋白酶体途径降解DRM2，通过CFK1过表达和对照的拟南芥进行全基因组亚硫酸氢盐测序(BS-seq)，发现CFK1过表达在特定DRM2靶位点诱导全基因组CHH低甲基化和转录去抑制，本研究揭示了CFK1调控DNA甲基化水平的一种独特机制(Chen et al. 2021)。
参考文献
1.Chen, J., Liu, J., Jiang, J., Qian, S., Song, J., Kabara, R. et al. (2021). F-box protein CFK1 interacts with and degrades de novo DNA methyltransferase in Arabidopsis. New Phytol., 229, 3303-3317.
2.Chen, K., Zhang, J., Guo, Z., Ma, Q., Xu, Z., Zhou, Y. et al. (2016). Loss of 5-hydroxymethylcytosine is linked to gene body hypermethylation in kidney cancer. Cell Res., 26, 103-118.
3.Law, P.P. & Holland, M.L. (2019). DNA methylation at the crossroads of gene and environment interactions. Essays Biochem, 63, 717-726.
4.Schübeler, D. (2015). Function and information content of DNA methylation. Nature, 517, 321-326.
5.Urich, M.A., Nery, J.R., Lister, R., Schmitz, R.J. & Ecker, J.R. (2015). MethylC-seq library preparation for base-resolution whole-genome bisulfite sequencing. Nat. Protoc., 10, 475-483.
