RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助发现miRNA的调节靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP是染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等）。RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq），将RIP与新一代测序技术结合起来，在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀）技术介绍
实验原理
★用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
★防止非特异性的RNA的结合。
★免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
★结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。
实验流程
生命之美的优势
★拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，质量可靠。
★拥有Illumina HiSeq 2500、MiSeq等多种高通量测序平台。
★技术人员经验丰富，可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。
★拥有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。
应用领域
★研究肿瘤发生和转移中microRNA失调的有力工具。
肿瘤转移中miRNA调控的信号通路（Nicoloso et al. Nature Rev Cancer 2009）。在癌症恶化过程中，通常表达上升的miRNA以红色方框表示，而表达下降的miRNA以灰色方框表示。有助于上皮细胞-间充质转化的蛋白编码基因以绿色方框表示。EMT：epithelial-mesenchymal transition，上皮细胞-间充质转化；ECM：extracellular matrix，胞外基质。
送样要求
★对于组织样品
1. 样品总量：≥ 5g。
2. 样品保存：新鲜的样品先在液氮中速冻，-80℃保存，干冰运输。
3. 样品包装：我们建议使用1.5ml离心管装载样品，并且用封口膜密封。请在各样品管上做好清楚的标识，最好写在标签纸上，贴在管壁。
★对于细胞样品
1. 样品总量：≥500ul干体积。
2. 样品保存：培养好的细胞用预冷PBS漂洗三次，收集的细胞在液氮中保存，干冰运输。
3.样品包装：我们建议使用1.5ml离心管装载样品，并且用封口膜密封。请在各样品管上做好清楚的标识，最好写在标签纸上，贴在管壁。
我们的服务内容
我们为VIP客户提供从实验设计，样品制备，测序，数据挖掘，到科学问题解析的整体方案。
参考文献
Baroni TE, Chittur SV, George AD, Tenenbaum SA (2008) Advances in RIP-chip analysis: RNA-binding protein immunoprecipitation-microarray profiling. Methods Mol Biol 419, 93-108.
Chen HH, Lebon J, Riggs AD (2008) Analysis of RNA structure and RNA-protein interactions in mammalian cells by use of terminal transferase-dependent PCR. Methods Mol Biol 488, 319-41.
Hieronymus H, Silver PA (2003) Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nature Genet 33, 155-161.
Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128, 735-745.
Terzi LC, Simpson GG (2009) Arabidopsis RNA immunoprecipitation. Plant J 59, 163-168.
Zhao J, Sun BK, Erwin JA, Song JJ, Lee JT (2008) Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science 322, 750-756.
CLIP-seq技术介绍
CLIP-seq (crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing)，紫外交联免疫沉淀结合高通量测序，可以高通量研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标的结合模式，并揭示其在一些重要生物学过程中的功能，是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术。最近，这项技术也被应用到microRNA靶标鉴定等工作中。
建库流程图
分析流程图
详细分析流程
4.1 数据基础分析：
- 测序质量分析；
- 测序有效长度分析；
- cDNA文库的代表性分析。
4.2 全基因组定位分析：
- Reads与参考基因组比对分析；
- Reads在基因组不同区域分布情况；
- Reads的Rfam分类分析；
- Reads在gene/mRNA区分布分析；
- Reads在转录起始位点（TSS）附近的分布分析；
- Reads在转录终止位点（TTS）附近的分布分析；
- Reads在翻译起始位点（Start codon）附近的分布分析；
- Reads在翻译终止位点（Stop codon）附近的分布分析。
4.3 CLIP-seq高级分析：
在这部分分析中，我们开发的分析策略为：In silico random IP（仅使用unique reads进行分析，见图3）。对选定的基因中，根据定位到此基因的observed tag number with observed length产生随机序列，对此基因进行模拟定位500次，找出500次中maximal random tag height (p_value<0.01)，如果此基因中observed max peak height<max random tag height, 则被过滤掉该；反之，会被保留为鉴定出的peak。
4.4 高级分析主要包括：
- 基因组上结合峰（peak）分布情况；
- 结合峰的峰宽分析；
- 结合峰的峰间距分析；
- IP样本特异结合峰（specific peak）分析（与对照样本相比较）；
- 结合基序（motif）分析；
- 结合峰所在基因分析；
- 结合峰所在基因的GO分类分析；
- 结合峰所在基因的功能聚类分析（DAVID）;
- 结合峰所在基因的GO富集性分析;
- 结合峰所在基因的KEGG分析。
分析结果展示