衰老伴随着基因表达的系统性变化，其中不仅包括编码序列的表达量变化，还涉及转录后调控的广泛参与，如选择性剪接、RNA编辑、poly(A)尾动态调控等。传统的短读长RNA测序依赖于cDNA合成和片段组装，难以准确识别全长异构体、RNA修饰和结构变异。
牛津纳米孔直接RNA测序（DRS） 通过直接读取RNA分子，避免了反转录引入的偏差，能够同时获取转录本的序列信息、修饰状态和3’尾长度，是研究复杂转录组事件的理想工具。 
 
 
英文题目: Full-length direct RNA sequencing reveals extensive remodeling of RNA expression, processing and modification in aging Caenorhabditis elegans中文题目: 全长直接RNA测序揭示衰老线虫中RNA表达、加工和修饰的广泛重塑

 

发表期刊: Nucleic Acids Research

发表时间: 2024.10

DOI:10.1093/nar/gkae1064

2024年发表于《Nucleic Acids Research》的一项研究中，Schiksnis等人利用Nanopore DRS技术，结合Illumina短读长测序，系统性地揭示了线虫（C. elegans）在衰老过程中RNA表达、剪接、修饰等方面的动态变化，展示DRS技术在全长转录本鉴定、RNA修饰检测、poly(A)尾长度分析等方面的独特优势，为广大科研工作者提供技术参考。
 
   

技术亮点：双平台测序策略优势互补的第一步

 
 
本研究采用Nanopore DRS与Illumina RNA-seq双平台并行策略，分别从八个成年时间点（1至15天）收集样本，涵盖生殖期与衰老期。这种设计不仅保证了数据的全面性，也充分发挥了两种技术的优势：● Illumina RNA-seq：高精度、高覆盖度，适用于差异表达分析；

 

● Nanopore DRS：全长读取，支持异构体鉴定、修饰检测和尾部分析。

 
 
结果显示，两种平台在基因表达量上高度相关（R² > 0.9），印证了DRS数据的可靠性。
 
 

研究发现  

 
01 发现大量新型异构体和3‘UTR
研究人员对纳米孔DRS原始数据进行了严格过滤，获得了超过1900万条高质量的全长读长，发现：● 新型异构体：通过使用FLAIR流程并结合Illumina短读长数据校正剪接位点，共鉴定出超过14,000种异构体。其中，813种是未被 WormBase 数据库注释的新型异构体，涉及782个基因。

 

● 新型3’UTR：研究还发现了617个新型3‘UTR，其3’末端与已知注释相差超过10 bp。

● 实验验证：通过RT-PCR和Sanger测序，成功验证了多个新型剪接异构体以及两个罕见的基因间融合转录本（如 lat-1 和 enol-1 的融合），证明了这些发现的可靠性。

 
02 衰老过程中出现特异性转录本异构体的积累
研究人员利用高精度的Illumina数据和SUPPA2软件，基于DRS提供的全长注释来分析可变剪接事件，发现：● 与成年第1天相比，在衰老后期（第7、10、15天）多个基因发生了显著的可变剪接事件，包括外显子跳跃、互斥外显子使用、内含子滞留和可变第一个外显子使用等。

 

● 这些发生可变剪接的基因功能涉及应激抵抗和运动能力，提示剪接变化可能与衰老相关的功能衰退有关。

 
 
03 RNA加工保真度在衰老过程中出现全局性但轻微的下降
研究人员将年轻成虫（第1-3天）和年老成虫（第7-15天）的数据进行合并比较，以观察全局趋势：● 剪接保真度：与年轻个体相比，年老个体中未注释的剪接 junction 读长比例显著增加，表明剪接准确性有所下降。

 

● 转录终止效率：映射到基因间区域的读长比例在年老个体中也显著增加，提示转录终止效率可能降低或转录起始位点选择出现错误。

● 内含子滞留：与之前某些研究不同，本研究未发现衰老导致内含子滞留的显著增加。这种差异可能源于更严格的内含子区域定义。

 
04 Poly(A) 尾长度在衰老过程中发生整体性变化
利用纳米孔DRS直接测量poly(A)尾长度，发现年老动物的尾长中位数（53 nt）比年轻动物（50 nt）有轻微但显著的延长：● 表达量与尾长的负相关：研究确认，无论是在年轻还是年老动物中，高表达转录本依然保持较短的poly(A)尾，这一保守规律仍然成立。

 

● 特异性变化：虽然81%的转录本尾长变化很小（<10 nt），但有一小部分（3.8%）基因的尾长发生了大幅变化（>20 nt）。其中一些基因（如与应激反应、脂肪酸结合等相关的基因）的尾长变化与其表达量变化无关，暗示它们可能受到特异性的调控。

 
05 肌苷（A-to-I）编辑的频率和范围在衰老过程中显著增加
通过分析Illumina数据中的A-to-G错配，在年轻和年老动物中分别鉴定出超过3800个高置信度的A-to-I编辑位点，其中大部分位于3‘UTR。● 衰老效应：

 

○ 数量增加：在年老动物中检测到的编辑位点总数更多。

○ 频率升高：在年轻和年老动物中都存在的2659个位点中，有904个位点的编辑频率在年老时发生变化，其中98%是编辑频率升高（增幅>10%）。

● 功能影响：位于编码区的编辑位点许多可能导致错义突变，改变氨基酸的化学性质，从而有潜力影响蛋白质功能。此外，许多编辑位点与重复序列和microRNA结合位点重叠，可能影响RNA的稳定性和调控。

 
06 首次在全基因组范围内发现并验证了线虫mRNA中的假尿苷修饰，且其数量随年龄增加
利用NanoPsu软件分析纳米孔DRS数据，首次绘制了线虫mRNA的假尿苷（Ψ）修饰图谱。在年轻和年老动物中分别鉴定出312和476个高置信度的Ψ位点，其中大多数位于编码区。● 衰老效应：携带Ψ修饰的基因数量在衰老过程中显著增加。约一半在年老动物中发现的Ψ修饰基因是年龄特异性的。

 

● 组织特异性：与肌苷编辑类似，带有Ψ修饰的mRNA在生殖系中表达量最高。

● 实验验证：通过硫酸氢盐处理结合Sanger测序，在 rnh-2 mRNA 和 rrn-1.1 rRNA 上成功验证了Ψ位点的存在，为这一发现提供了坚实证据。

 
07 为新发现的衰老相关基因注释了新特征
研究人员将本研究的所有新发现（新型异构体、3‘UTR、可变剪接、RNA修饰）与已知的1484个促进或抑制长寿的基因列表进行比对，发现：● 227个已知的衰老相关基因具有至少一项本研究揭示的新转录组特征（如 daf-2, erm-1, prdx-2 等）。这为了解这些关键基因在衰老过程中复杂的转录后调控机制提供了全新线索。
 

DRS技术价值总结  

 
DRS技术的核心价值在于其 “一体化”和“直接性” 。一次实验即可同时获得关于序列、结构、丰度和修饰的多维信息，提供了一个前所未有的、更接近生物真实状态的转录组视图。

 

而传统技术通常需要多个独立的实验和复杂的生物信息学推断才能拼凑出部分信息，且在分辨率、准确性和完整性上存在固有局限。

这使得DRS在探索转录组复杂性、RNA修饰动态调控等前沿领域成为一项变革性工具。

 
 
参考文献Schiksnis EC, Nicastro IA, Pasquinelli AE. Full-length direct RNA sequencing reveals extensive remodeling of RNA expression, processing and modification in aging Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 2024;52(22):13896-13913. doi:10.1093/nar/gkae10