CLIP-seq项目文章 | RNA 结合蛋白 Lgals3、铁死亡与急性肾损伤

与铁死亡相关：通过对基因表达谱的分析（如 RNA 测序、KEGG 分析、GSEA 分析等），发现差异表达基因（DEGs）主要富集在与铁死亡相关的通路中。同时，电镜观察到肾脏线粒体形态改变，且关键铁死亡标志物（MDA、GSH 和 Fe 2+ ）水平变化证实了铁死亡的发生。这一系列结果表明，Lgals3 表达变化与 AKI 过程中的铁死亡密切相关 。

作用机制为激活铁死亡：在构建的体内 AKI 模型中，通过实验观察到 Lgals3 基因敲除可显著减少脂质过氧化的积累和线粒体皱缩数量的增加，而 Lgals3 过表达则出现相反现象。同时，使用铁死亡抑制剂 Fer-1 处理后，能缓解由 Lgals3 过表达或顺铂诱导的肾脏损伤。这些结果说明，Lgals3 在体内加剧肾脏损伤的作用机制是激活铁死亡。

通过促进铁死亡实现：从铁死亡相关指标来看，过表达 Lgals3 时，细胞内脂质过氧化产物 MDA 水平上升、抗氧化物质 GSH 水平下降，线粒体损伤加剧且脂质过氧化积累增多；敲低 Lgals3 或使用铁死亡抑制剂 Fer-1 处理后，这些铁死亡相关指标得到改善。此外，使用铁死亡激活剂 erastin 进一步验证，敲低 Lgals3 能抑制 erastin 诱导的铁死亡。这些结果充分说明 Lgals3 在体外通过推动铁死亡进程，进而加剧肾脏损伤。

确定靶标 Nr4a1：将 Lgals3 结合的基因与 Lgals3 敲除小鼠肾脏和 HK-2 细胞中的差异表达基因整合分析，筛选出 4 个共同基因，其中 Nr4a1 在顺铂处理下表达显著变化，且受 Lgals3 敲除的影响明显。进一步通过结合峰分析、双荧光素酶报告实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）等实验，证实 Lgals3 能够与 Nr4a1 的 3’UTR 区域结合，从而确定 Nr4a1 是 Lgals3 的作用靶标。

相互作用的方式与位点：研究人员通过对 CLIP-seq 数据进行基序富集分析，发现 AAUAAA 是 Lgals3 结合位点中最丰富的元件。为验证其与 Nr4a1 的关系，设计了 Nr4a1 3′UTR 野生型和突变型质粒进行双荧光素酶报告实验，结果显示仅在 Lgals3 敲低且 Nr4a1 3′UTR 为野生型的组中，荧光素酶活性显著增加。同时，通过电泳迁移率变动分析（EMSA），使用纯化的 Lgals3 蛋白进一步证实了 Lgals3 能与 Nr4a1 的 3’UTR 区域中的 AAUAAA 序列相互作用。

体外实验：在 HK-2 细胞中敲低 Nr4a1，通过细胞活力检测、LDH 释放检测、TUNEL 和 PI 染色等实验，证明了抑制 Nr4a1 能减轻铁死亡激活剂 erastin 刺激下的细胞损伤。同时，透射电镜和 C11-Bodipy 染色结果表明，敲低 Nr4a1 可阻止 erastin 诱导的铁死亡激活，表明在体外抑制 Nr4a1 同样能减轻肾脏细胞损伤。

作用机制：体内外实验均表明，抑制 Nr4a1 减轻肾脏损伤主要是通过消除铁死亡来实现的，这揭示了 Nr4a1 在调节肾脏损伤与铁死亡之间的关键联系。

关键调控关系：确定了 Nr4a1 通过直接结合 Bap1 的启动子区域，实现对 Bap1 转录的调控，进而影响铁死亡过程。这表明 Nr4a1 在调控铁死亡中并非独立发挥作用，而是与 Bap1 存在紧密的上下游调控联系。

对铁死亡的影响：在 AKI 的背景下，Nr4a1 对 Bap1 的调控最终导致铁死亡的激活或抑制。当 Nr4a1 结合到 Bap1 启动子促进其转录时，会促使细胞发生铁死亡；敲除或抑制 Nr4a1，则会减少 Bap1 表达，从而抑制铁死亡，减轻肾脏损伤。这一机制明确了 Nr4a1 在 AKI 相关铁死亡中的关键推动作用。

对铁死亡的影响：经 GB1107 处理后，通过检测关键指标发现，其能显著缓解铁死亡现象。例如，C11-Bodipy 染色和透射电镜（TEM）结果显示，脂质过氧化水平降低，线粒体损伤减轻，这表明铁死亡进程得到有效抑制。

对肾脏损伤的作用：在评估肾脏功能方面，GB1107 处理组小鼠的肾功能指标（如血尿素氮 BUN 和肌酐）明显改善；肾脏组织的病理染色（如 HE、TUNEL 染色）结果表明，肾脏损伤程度减轻。此外，蛋白质免疫印迹分析显示，GB1107 能有效抑制 Nr4a1 和 Bap1 的表达，进一步说明其减轻肾脏损伤的效果。