单细胞RNA测序显示，参白解毒通过调控免疫抑制树突状细胞的 TMEM131-TNF 信号通路介导分化，延缓结直肠肿瘤发生
本研究利用单细胞RNA测序技术，首次揭示中药复方参白解毒方（SBJDD） 通过调控TMEM131-TNF信号通路，抑制CCL22⁺免疫抑制性树突状细胞的分化与功能，从而有效延缓结直肠肿瘤发生，其活性成分小檗碱是关键效应分子。
研究背景
结直肠癌是我国高发的恶性肿瘤之一，其发生发展与肿瘤微环境密切相关。近年来，免疫细胞在肿瘤发生中的作用备受关注，其中树突状细胞作为抗原提呈的核心细胞，既可激活抗肿瘤免疫，也可能在特定条件下转化为免疫抑制性亚群，促进肿瘤免疫逃逸。
参白解毒方（SBJDD）是一种临床用于结直肠腺瘤防治的中药复方，前期研究已证实其具有降低腺瘤复发率的作用。然而，SBJDD如何重塑肿瘤微环境、调控免疫细胞功能，其具体机制尚不明确。
本研究通过单细胞转录组学，系统描绘了SBJDD干预下结直肠肿瘤微环境的细胞图谱，揭示了其关键靶点与信号通路，为中药复方的现代化研究提供了新范式。
技术路线
1. 动物模型：使用ApcMin/+自发性结直肠癌小鼠，给予高脂饮食诱导肿瘤发生，同时灌胃SBJDD。
2. 临床验证：收集多发性结直肠腺瘤患者服用SBJDD前后的组织样本。
3. 单细胞测序：对小鼠和临床样本进行10x Genomics单细胞RNA测序，构建肿瘤微环境细胞图谱。
4. 细胞互作与轨迹分析：利用CellChat、拟时序分析等手段，揭示细胞分化轨迹与免疫细胞间相互作用。
5. 机制验证：通过基因敲低、分子对接、表面等离子体共振等方法，鉴定关键靶点与活性成分。
6. 成分分析：采用UHPLC-QTOF-MS鉴定SBJDD入血成分，筛选关键活性分子。
研究发现
SBJDD抑制结直肠肿瘤发生与CNV水平
建立 ApcMin/+ 自发性结直肠癌小鼠模型（n=7/组），给予高脂饮食，SBJDD灌胃干预12周。通过H&E染色、Ki67免疫组化评估肿瘤负荷与增殖活性。对48,992个单细胞进行10x Genomics单细胞RNA测序（样本来源：正常组、ApcMin/+模型组、SBJDD治疗组小鼠结直肠组织）。利用InferCNV推断上皮细胞拷贝数变异。
具体发现：
● SBJDD显著减少肿瘤数量（从模型组的平均15.2个降至4.3个）、体积与恶性程度
● Ki67阳性细胞比例从模型组的42.7%降至18.3%
● 单细胞UMAP聚类显示5大细胞类型（上皮细胞、基质细胞、髓系细胞、B细胞、T细胞）及40个细胞亚型
● 上皮细胞CNV评分：模型组显著高于正常组，SBJDD治疗组显著降低
Ccl22+ DCs在肿瘤微环境中显著富集
对上述48,992个单细胞数据进行细胞亚群丰度分析（Ro/e比值），结合TCGA-COAD数据库计算AUCell评分。利用mIHC多重免疫组化（样本：小鼠结直肠组织切片）验证细胞浸润。采用Monocle2进行拟时序分析，追踪髓系细胞分化轨迹。
具体发现：
● Ro/e分析显示 Ccl22+ DCs在模型组显著富集（Ro/e > 2），SBJDD治疗后富集程度降低
● TCGA数据库中 CCL22+DCs在CRC组织中AUCell评分显著高于正常组织
● mIHC证实：模型组 CCL22+ DCs密度为正常组的4.2倍，SBJDD治疗后下降至1.8倍
● 拟时序分析揭示 Ccl22+DCs来源于 Wdfy4+ DCs，位于分化轨迹末端，伴随TNF信号通路相关基因上调
Ccl22+ DCs与Treg细胞形成免疫抑制网络
使用CellChat进行细胞间配体-受体互作分析（基于小鼠scRNA-seq数据）。mIHC共定位分析检测 CCL22+ DCs与 CD4+FOXP3+ Tregs的空间距离。基于TCGA数据库进行相关性分析。组织微阵列（TMA，样本：90例结直肠癌患者组织）验证细胞丰度相关性。
具体发现：
● CellChat显示 Ccl22+DCs与 CD4+ Tregs之间互作强度在模型组显著增强，主要介导分子为 CD80/CD86–CTLA4
● mIHC证实：模型组中 CCL22+ DCs与Tregs平均空间距离缩短至12.3μm（正常组为28.5μm），SBJDD治疗后恢复至21.6μm
● TCGA数据库分析：CCL22表达与 FOXP3、CTLA4 呈显著正相关
● TMA验证：CCL22+ DCs与 CD4+FOXP3+Tregs丰度呈显著正相关
临床样本验证SBJDD重塑微环境
收集3例多发性结直肠腺瘤患者治疗前后的配对组织样本（共6份），进行10x Genomics单细胞RNA测序（总细胞数39,500个）。CNV分析评估上皮细胞恶性程度。拟时序分析追踪DC分化轨迹。
具体发现：
● 治疗后腺瘤体积缩小，CNV评分显著降低
● UMAP聚类显示17个细胞亚型，治疗后DC与Treg细胞比例下降
● DC进一步分为DC_1与DC_2两个亚型，治疗后DC_2比例显著减少
● 拟时序分析显示DC_2来源于DC_1，位于分化轨迹末端，伴随MHC分子表达下调
● 分子特征对比：DC_1与小鼠M03 DCs相似，DC_2与小鼠M05 (Ccl22+) DCs相似
Ccl22+DCs的诱导与功能验证
从小鼠骨髓分离imDCs，用LPS（100 ng/mL）联合胆固醇（50 μg/mL）诱导 Ccl22+DCs分化（体外实验，n=3/组）。磁珠分选 CD4+CD62L+ naive T细胞诱导Treg分化。将诱导的 Ccl22+DCs腹腔注射至 ApcMin/+ 小鼠（1×106细胞/只，每周1次），评估肿瘤负荷（n=7/组）。
具体发现：
● 胆固醇联合LPS显著上调 Ccl22、Ccr7、Cd80、Cd86 表达（较单药组增加2-4倍）
● 诱导的 Ccl22+ DCs与Treg共培养后，Treg中CTLA4表达升高（MFI值从342升至587）
● 体内实验：SBJDD单独治疗组肿瘤数降至4.1个，联合 Ccl22+ DCs注射后肿瘤数回升至10.6个（与模型组无显著差异），证实 Ccl22+DCs可逆转SBJDD疗效
● Ki67阳性细胞比例：SBJDD组（18.5%）→ SBJDD+ Ccl22+ DCs组（39.2%）
TMEM131通过TNF信号通路调控Ccl22+) DCs
对 Ccl22+ DCs进行差异表达基因分析（不同干预组间）。构建TMEM131 shRNA慢病毒（3条序列）敲低 Ccl22+DCs中TMEM131表达，进行bulk RNA-seq（n=3/组）。qPCR与Western blot验证TNF通路分子。基于TCGA数据库分析 TMEM131 与TNF通路相关性。
具体发现：
● 差异基因与拟时序基因交集筛选出 Tmem131
● 拟时序轨迹显示 Tmem131 在 Ccl22+ DCs分化过程中表达量递增（从Wdfy4⁺ DCs的2.1倍升至末端的6.8倍）
● 敲低TMEM131后，Ccl22表达下降72%，TNF通路分子 Traf2（下降65%）、Tnfa（下降58%）显著下调
● TCGA分析：TMEM131 表达与TNF通路评分呈正相关
● KEGG富集分析显示敲低组下调基因显著富集于TNF信号通路
小檗碱是SBJDD中靶向TMEM131的活性成分
采用UHPLC-QTOF-MS分析SBJDD灌胃后小鼠血清中的入血成分（n=3）。UHPLC-QTRAP-MS/MS定量检测小檗碱含量。分子对接（CB-Dock2）预测小檗碱与TMEM131的结合模式。表面等离子体共振（SPR）测定结合亲和力。体外实验：小檗碱（20 μmol/L）处理 Ccl22+DCs，检测相关基因表达及TNF通路分子。
具体发现：
● 血清中鉴定出28种原型成分，包括7种生物碱、6种黄酮等，小檗碱在肠道组织中显著富集
● 分子对接显示小檗碱与TMEM131结合能为-7.5 kcal/mol
● SPR测定结合常数 KD=5.03×10−6mol/L，证实中等强度直接结合
● 小檗碱处理后，Ccl22+DCs中 Ccl22下降62%、Ccr7下降54%，TRAF2蛋白下降58%、TNFA下降47%
● 小檗碱处理后的 Ccl22+ DCs与Treg共培养，Treg中CTLA4 MFI值从568降至314
总结
本研究通过单细胞转录组学与成分分析相结合的策略，系统阐明了参白解毒方（SBJDD）延缓结直肠肿瘤发生的作用机制：
1. 关键细胞亚群：Ccl22+树突状细胞是一种免疫抑制性DC，在肿瘤微环境中显著富集，与Treg细胞协同形成免疫抑制网络；
2. 核心分子靶点：TMEM131通过调控TNF信号通路，驱动Ccl22+ DCs 的分化与功能；
3. 主要活性成分：小檗碱是SBJDD中靶向TMEM131的关键效应分子，可抑制该通路活化；
4. 治疗意义：SBJDD通过减少 Ccl22+DCs 的浸润与免疫抑制功能，重塑肿瘤微环境稳态，延缓肿瘤发生。
该研究为中药复方“成分-靶点-细胞-通路”的系统性机制解析提供了范例，也为结直肠癌的免疫预防与治疗提供了新的策略与候选分子。
参考文献：
Tao, Yuquan et al. “Single-cell RNA sequencing reveals Shen-Bai-Jie-Du decoction retards colorectal tumorigenesis by regulating the TMEM131-TNF signaling pathway-mediated differentiation of immunosuppressive dendritic cells.” Acta pharmaceutica Sinica. B vol. 15,7 (2025): 3545-3560. doi:10.1016/j.apsb.2025.05.013