技术简介

      1958年，克里克提出“中心法则”，阐述了DNA、RNA与蛋白质间的信息流动。基因转录成前体RNA，经过可变剪接形成不同转录本，进而翻译成蛋白质异构体。选择性剪接使基因产生多种异构体，具有不同的结构和功能，表达具有特异性。《Nature Reviews Drug Discovery》近期探讨了蛋白质异构体在药物发现中的作用，提出利用异构体增强药物特异性和效果。因此，研究前体RNA选择性剪接调节转录本及其翻译机制，对开发以蛋白质异构体为中心的治疗方法至关重要。Poly(A)尾是mRNA的关键结构元素，对mRNA的稳定性和翻译过程至关重要，但我们常忽视其背后的表观遗传调控机制。测序技术的进步使我们能够全面深入地分析poly(A)尾的长度和构成，揭示了其丰富的调控信息，为基因表达调控提供了新的视角和可能。

       以Nanopore为代表的第三代测序技术，因其对同源多聚序列的不敏感性，使得它们能够执行精确的poly(A)尾测序。Nanopore平台尤为突出，它不仅能够通过DRS测序得到polyA尾长度，也有一些研究者开发了适配ONT平台可以测序poly（A）尾长度的技术，比如FLEP-seq、FLEP-seq2以及Nano3P-seq等。目前Nanopore官方最新版的长读长转录组建库试剂盒也能够测序poly（A）尾长度，建库原理跟ONT-IrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies long-read RNA sequencing）不同，为了跟ONT-IrRNA-seq测序技术区分，我们将新版建库测序技术称为：ONT-PAIrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies Poly(A) inclusive long-read RNA sequencing ）。无论是通过cDNA测序还是DRS测序，Nanopore测序技术都能揭示poly(A)尾巴内的非A残基，这一特性为其在RNA研究领域的应用提供了强大的支持。

技术优势

✔  完善基因注释：发现新的转录本和基因，获得全面的转录组图谱。
✔  差异分析：差异表达基因（DEG）、差异表达转录本(DET)、差异使用转录本(DTU)。
✔  基因结构分析：准确分析可变剪接(AS)、多聚腺苷酸化位点（APA），3’UTR长度、polyA长度。
✔  转录本分辩率：在转录本水平上解析基因表达的调控机制及其功能。
✔  绝对定量：UMI序列能够非常准确定量转录本。

实验步骤及流程图

     首先通过olig dT磁珠捕获获得含有polyA尾巴的RNA，接着使用T4 DNA连接酶将一段固定序列+6个T碱基突出的双链引物与RNA的3’末端最后一个A碱基连接起来，然后消解掉双链引物未被连接的那条链。接着加入RT引物逆转录，把TSO+UMI序列通过链置换方式添加到cDNA 3’末端，使用引物PCR扩增形成双链cDNA，最后将双链cDNA末端进行修平和连接ONT测序接头形成测序文库。

送样要求

详细信息请参考推文：送样规范 | 武汉瑞兴生物三代建库测序类相关产品送样取样建议

案例应用

案例1

Nano3P-seq: transcriptome-wide analysis of gene expression and tail dynamics using end-capture nanopore cDNA sequencing

中文标题：Nano3P-seq：使用末端捕获纳米孔 cDNA 测序对基因表达和尾部动力学进行全转录组分析

期刊名：Nature Methods

影响因子IF：36.1

技术方法：Nanopore 3′ end-capture sequencing 

RNA多腺苷酸化在RNA成熟、命运和稳定性中起核心作用。polyA尾长变化影响mRNA翻译效率和稳定性。作者开发了Nano3P-seq，利用纳米孔cDNA测序量化RNA丰度、尾部组成和长度动态。Nano3P-seq无需PCR扩增或RNA接头连接，可从RNA分子3’端开始测序。该方法可定量估计RNA丰度和尾长，并捕获多种RNA生物型。在小鼠和斑马鱼中，发现16S线粒体rRNA也有多聚腺苷酸尾。mRNA尾长在脊椎动物胚胎发生过程中受动态调节，与mRNA衰减相关。Nano3P-seq能捕获不同长度PolyA尾内非A碱基，揭示其在脊椎动物胚胎发生中的分布。总体而言，Nano3P-seq是一种简单、稳健的方法，准确估计转录水平、尾长和尾部组成异质性，且文库制备偏差最小。

案例2

An atlas of plant full-length RNA reveals tissue-specific and monocots–dicots conserved regulation of poly(A) tail length

中文标题：植物全长 RNA 图谱揭示了组织特异性和单子叶植物-双子叶植物对 poly(A) 尾长的保守调控

期刊名：Nature Plants

影响因子IF：15.8

样本：拟南芥七种不同组织

技术方法：FLEP-seq2

Poly(A)尾巴是真核信使RNA的关键特征，其长度在调控mRNA代谢过程中占据举足轻重的地位。然而，目前尚未构建出全面反映植物poly(A)尾长的资源库。在此，我们创新性地运用了一种无需poly(A)富集的纳米孔技术，以解析植物中携带poly(A)尾部信息的全长RNA序列。我们构建的数据库囊括了拟南芥七种不同组织中的逾1.2亿个聚腺苷酸化mRNA分子，并扩展至玉米、大豆和水稻的芽组织样本。
分析结果显示，在多数植物组织中，poly(A)尾巴的长度分布呈现出两个主要峰值，分别位于约20和45个核苷酸处。值得注意的是，花粉中的poly(A)尾巴展现出独特的分布模式，其强峰集中在55和80个核苷酸处。此外，我们还发现poly(A)尾巴的长度受基因特异性调控——那些半衰期较短的mRNA分子往往携带更长的poly(A)尾巴，而半衰期较长的mRNA分子则倾向于具有相对较短的poly(A)尾巴，其长度峰值约在45个核苷酸附近。
进一步比较不同物种间的差异，我们观察到在细胞核中，poly(A)尾巴的长度几乎是细胞质中的两倍。这一发现为深入探索植物poly(A)尾长调控的生物学功能和进化历程提供了宝贵的数据支持。我们的综合数据集无疑将成为未来相关研究的重要基石。

参考文献

【1】 Kjer-Hansen, P., Phan, T.G. & Weatheritt, R.J. Protein isoform-centric therapeutics: expanding targets and increasing specificity. Nat Rev Drug Discov (2024).

【2】Jia, J., Lu, W., Liu, B. et al. An atlas of plant full-length RNA reveals tissue-specific and monocots–dicots conserved regulation of poly(A) tail length. Nat. Plants 8, 1118–1126 (2022).