项目文章 | 瑞兴单细胞三代助力Science Advances：揭示SRSF3决定Treg在抗肿瘤免疫与自身免疫中的双重角色 – 空间转录组 | 单细胞多组学 | 三代测序

近日，武汉大学贾荣教授团队在 Science Advances 发表重磅研究 “ SRSF3 determines Treg cell fate in antitumor immunity and autoimmunity ”，揭示了剪接因子SRSF3通过调控FOXP3 exon 2可变剪接及翻译过程，决定调节性T细胞（Treg）的命运与功能，从而影响抗肿瘤免疫和自身免疫稳态。

瑞兴生物为该研究提供了单细胞转录组测序（DNBelab C）及单细胞三代全长转录组测序（Oxford Nanopore）技术服务支持，助力研究者深入解析Treg细胞中SRSF3调控的可变剪接网络。

研究背景

调节性T细胞（Treg）是一类具有免疫抑制功能的CD4+ T细胞亚群，在维持自身免疫耐受、防止过度炎症中发挥核心作用，但在肿瘤微环境中却会抑制抗肿瘤免疫。FOXP3是Treg的主转录因子，人类FOXP3基因存在可变剪接——外显子2可被跳过，产生全长型（FOXP3FL）和缺失型（FOXP3Δ2）两种亚型，大量研究提示，FOXP3 exon 2对于Treg抑制功能至关重要。缺失exon 2会削弱FOXP3介导的转录抑制能力，影响其与NF-κB、RORα等因子的调控作用。然而，调控FOXP3外显子2剪接的关键因子及其在抗肿瘤免疫与自身免疫中的功能尚不清楚。

研究设计

体外机制

构建人/鼠 Foxp3 minigene 突变体 → 定位外显子2剪接的关键内含子区及外显子内 ESE 增强子
筛选7种剪接因子 → 鉴定 SRSF3 为核心调控因子
RNA pull-down + RNA免疫沉淀 → 验证 SRSF3 与外显子2直接结合
构建不含内含子的 FOXP3 ORF 质粒 → 区分 SRSF3 在剪接与翻译两层面的调控作用

体内功能

构建 人源化小鼠（Foxp3-Hu） 模拟外显子2跳跃 → MC38 结肠癌模型 → 评估肿瘤生长与 Treg 功能 → scRNA-seq 解析肿瘤 Treg 转录组（瑞兴支持）
构建 Treg 特异性 Srsf3 敲除小鼠（Srsf3-cKO） → 组织病理 + 流式 + 自身抗体检测 → 明确 SRSF3 对 Treg 发育、稳定性及免疫耐受的必要性

临床验证

口腔鳞癌 / 乳腺癌 患者肿瘤及癌旁组织 → 流式检测 SRSF3/FOXP3 表达
TCGA 数据库（Spliceseq）生存分析 → 验证 SRSF3/FOXP3 轴与癌症预后的相关性

深度解析

单细胞三代全长测序（瑞兴支持）→ 单细胞分辨率下全面鉴定 SRSF3 调控的 基因表达 及 可变剪接事件网络

研究发现：

01 FOXP3外显子2跳跃降低Treg功能，抑制肿瘤生长

研究方法：构建人源化小鼠（Foxp3-Hu，将小鼠Foxp3外显子2及上下游50 bp内含子替换为人源序列），接种MC38结肠癌细胞，通过流式、RT-PCR和scRNA-seq分析Treg功能。

研究发现：

人源化小鼠出现FOXP3外显子2跳跃，Treg中FOXP3蛋白表达下降，但Treg数量、CD4/CD8 T细胞比例及活化状态无显著差异。
肿瘤接种后，人源化小鼠肿瘤生长显著减缓、生存期延长，肿瘤内CD8+ T细胞浸润显著增加。
scRNA-seq显示：人源化小鼠肿瘤Treg中Foxp3表达下调，同时Tnfr5f1b（TNFR2）、Gzmb（颗粒酶B）等与Treg功能相关的基因显著下调，GO富集提示炎症反应和线粒体呼吸通路改变。
TCGA数据库分析显示：FOXP3外显子2高保留与多种癌症（结肠癌、头颈癌、乳腺癌等）患者的不良预后显著相关。

总结：FOXP3外显子2跳跃会削弱Treg的免疫抑制功能，从而释放抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤生长并改善患者预后。

02 SRSF3通过结合外显子2内的ESE元件促进外显子保留

研究方法：构建人FOXP3 minigene，对外显子2进行系列突变以定位调控基序；共转染剪接因子表达质粒或siRNA筛选调控因子；RNA pull-down验证结合；在人工Treg细胞中验证。

研究发现：

突变筛选发现hmt10区域（位于外显子2内）是一个外显子剪接增强子（ESE），缺失该序列会显著降低外显子2保留。
在7个剪接因子中，SRSF3过表达显著促进外显子2保留，而hnRNP L和9g8抑制保留。
SRSF3敲低或使用SRSF3抑制剂SF1003均可显著促进外显子2跳跃。
RNA pull-down证实SRSF3直接结合于hmt10 ESE序列；RNA免疫沉淀证实SRSF3结合于FOXP3外显子2。
在人Treg细胞中，SRSF3敲低可降低外显子2保留及全长FOXP3蛋白表达，过表达则相反。

总结：SRSF3是调控FOXP3外显子2保留的关键剪接因子，通过直接结合外显子内的ESE增强子序列促进外显子2的保留。

03 SRSF3促进FOXP3全长蛋白的翻译

研究方法：构建不含内含子的FOXP3全长或Δ2 ORF表达质粒（3×Flag标签），在293细胞中共转染SRSF3表达质粒或siRNA，检测蛋白和mRNA水平。

研究发现：

SRSF3过表达显著增强全长FOXP3蛋白表达，但mRNA水平无显著变化，提示SRSF3在翻译水平促进FOXP3表达。
SRSF3敲低则降低全长FOXP3蛋白表达。
小鼠Foxp3（不含可变剪接）同样受SRSF3调控：过表达增强蛋白表达，敲低则降低，说明SRSF3对Foxp3的调控不依赖于剪接。

总结：SRSF3不仅在剪接水平调控外显子2保留，还在翻译水平促进FOXP3全长蛋白的表达，双重保障Treg功能。

04 肿瘤Treg中SRSF3高表达并与FOXP3正相关，预示不良预后

研究方法：收集口腔鳞癌（5例）和乳腺癌（8例）患者的肿瘤及癌旁组织，流式检测Treg中SRSF3和FOXP3表达；TCGA数据库分析SRSF3表达与患者生存及病理分级的关系。

研究发现：

口腔鳞癌和乳腺癌患者的肿瘤内Treg细胞中SRSF3和FOXP3表达均显著高于癌旁正常组织。
TCGA分析显示：SRSF3高表达与头颈癌、乳腺癌、食管癌患者的不良总生存期显著相关；肿瘤组织中SRSF3表达高于正常组织，且与病理分级正相关。
体外抑制实验证实：SRSF3敲低会削弱人Treg细胞对CD8+ T细胞增殖及IFN-γ、TNF-α、IL-2产生的抑制能力。

总结：肿瘤微环境中Treg通过上调SRSF3来维持高水平的FOXP3表达，从而增强免疫抑制功能，促进肿瘤进展并导致不良预后。

05 Treg特异性Srsf3敲除导致致死性自身免疫病

研究方法：构建Treg特异性Srsf3敲除小鼠（Foxp3^YFP-Cre × Srsf3^(flox/flox)），监测生长、存活、组织病理、免疫细胞及自身抗体。

研究发现：

Srsf3-cKO雄鼠3-5周内全部死亡，体重显著降低。
7日龄时胸腺和体重正常，无炎症，但Treg中Foxp3表达已下降。
死亡前（3-4周）出现严重系统性炎症：皮肤、肝、肺、肾等多器官炎症浸润，肾小球Bowman间隙缩小，心和颌下腺出现炎症。
Treg细胞数量显著减少，FOXP3表达降低，CD25下调。
血清抗dsDNA自身抗体升高；脾和淋巴结中CD4+、CD8+ T细胞的IFN-γ和IL-4表达上调。

总结：SRSF3是Treg细胞体内稳定维持所必需的，Treg中SRSF3缺失会严重破坏Treg的发育与功能，导致致死性自身免疫炎症。

06 单细胞三代测序揭示SRSF3广泛调控Treg中的基因表达与可变剪接

研究方法：利用单细胞三代全长测序（Oxford Nanopore），将Treg细胞按SRSF3表达量分为高（前25%）和低（后25%）两组，比较基因表达与可变剪接差异（瑞兴生物支持）。

研究发现：

基因表达：鉴定出660个显著差异表达基因，SRSF3高表达组中核糖体蛋白基因（Rps、Rpl系列）及Ebf1、Ptma等免疫相关基因显著上调，GO富集于核糖体功能、mRNA代谢、翻译起始。
可变剪接：检测到145个显著变化的剪接事件，涵盖外显子跳跃（SE）、可变5’/3’剪接位点（A5/A3）、内含子保留（RI）等多种类型，涉及Treg功能相关基因（如Tcirg1、Septin7、Cacna1e）。GO分析同样富集于免疫调节和细胞代谢通路。
SRSF3抑制剂SF1003在小鼠肿瘤模型中也验证了抑制SRSF3可降低Foxp3表达并抑制肿瘤生长。

总结：SRSF3在Treg中除了调控FOXP3外，还广泛影响大量基因的表达和可变剪接，构成一个复杂的免疫调节网络。