技术简介

真核生物在转录过程中，会对转录RNA进行一系列的加工，例如5’端加cap和3’端加多聚腺苷-Poly(A)尾。这种结构对于mRNA的稳定性和蛋白翻译非常重要。

1971年Edmonds就发现mRNA具有poly(A)尾巴，它是RNA转录后在其3’末端，通过非模板方式，由多种调控因子/酶添加的一连串的碱基，这些碱基绝大部分是A。poly(A)尾巴是绝大多数真核生物mRNA和长链非编码RNA的必要结构组分，对于RNA的转运、稳定性、翻译等至关重要。 

Poly(A)-seq ，即Poly(A)尾长度测序，该技术能够在全基因组水平上测量poly(A)尾巴的长度。大多数真核mRNA的3′非翻译区域下游含有一个非模板化的poly(A)尾巴，这个尾巴有助于mRNA的稳定和向细胞质的运输。poly(A)尾巴长度会影响mRNA的翻译效率，因此，Poly(A)-seq可以作为一种潜在工具去解析mRNA降解和翻译的动态调控过程，也能够发现一些RNA裂解和加尾的未知特点。

技术优势

✔  直接、便捷
✔  容易实现
✔  成本低
✔  通量高
✔  可信度高
✔  信息量丰富

技术应用

  1. 影响mRNA翻译效率、蛋白定位

  2. 参与mRNA的代谢、转运、mRNA的衰变、核输出

  3. 植物防御机制

  4. 肿瘤药物靶点

  5. PolyA-seq与Ribo-seq连用，可探索mRNA polyA尾的变化与翻译效率之间的调控关系。

  6. PolyA-seq与RNA-seq连用，可探索polyA尾的变化与mRNA稳定性之间的关系。

技术流程

图1：建库原理
图2：数据分析流程

案例解析

该技术在拟南芥的poly(A)加尾调控项目的研究中得到应用，揭示了拟南芥poly(A)尾介导的全新转录后调控机制——在poly(A)尾中散在分布的鸟苷酸（G）可通过抑制与poly(A)结合蛋白（PAB）的相互作用降低mRNA的翻译效率。该研究成果发表在Genome Biology 上(Zhao et al., 2019)。

在本课题中，通过对全长poly(A)尾进行测序并开发下游生物信息学算法提取高质量测序信息，发现在拟南芥的poly(A)尾中也存在非A核苷酸，并且同样是G的含量最高。研究人员随后以拟南芥poly(A)结合蛋白家族核心成员AtPAB2、AtPAB4和AtPAB8为研究对象，构建了一系列重要的突变体。

进一步结合CLIP-seq、ribo-seq和mRNA稳定性检测等高通量实验技术，在全基因组水平对poly(A)尾及其结合蛋白PAB的分子生物学功能进行了系统性研究，得出以下结论：

1、AtPAB广泛结合植物体内mRNA的poly(A)尾，但对不同mRNA的结合效率存在明显差异；

2、拟南芥中10%的poly(A)尾含有至少一个鸟苷（G），其含量在不同mRNA中的分布范围为0.8-28%；

3、AtPAB对不同mRNA的差异结合可以部分被其poly(A)尾中G含量的差异所解释——A的“纯度”越高，其与AtPAB的结合越强；

4、AtPAB对mRNA的结合可以提高mRNA的翻译效率；

5、相应的，在atpab 突变体中，带有不含G的“纯poly(A)尾”的mRNA翻译效率降低更为明显；

6、atpab2、atpab4、atpab8三突变体纯合致死，atpabs 的双突变体呈现多种发育异常表型，暗示了由poly(A)尾与其结合蛋白介导的翻译调节机制对植物的正常生长发育具有至关重要的调控作用。

该研究充分展示了二代测序技术与生物信息学算法的结合在解析生物大分子调控过程中的强大优势。其结果阐明了植物poly(A)尾中的G含量可通过抑制PAB结合影响蛋白翻译效率，是对近代分子生物学中心法则的拓展与创新。该研究对探究其他物种中mRNA的转录后调控机理具有重要参考价值。