在植物基因组学与转录组学研究领域，我们是否曾深受短读长测序技术的局限？例如转录本拼接不完整、无法准确识别融合基因、难以检测RNA修饰等。今天推荐一个正在迅速崛起的前沿技术——牛津纳米孔直接RNA测序（Direct RNA Sequencing, DRS），它正在彻底改变我们对植物转录组的理解方式。

 

直接RNA测序：直测完整天然RNA分子

 

直接RNA测序（Direct RNA Sequencing, DRS） 是牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）推出的一项革命性测序技术。它与传统RNA测序最根本的不同在于：无需将RNA逆转录为cDNA，也无需进行PCR扩增，而是直接对完整的、天然的RNA分子进行实时测序。

 

1 技术原理

单个RNA分子在牵引蛋白的引导下，以3‘→5’方向穿过纳米孔。不同碱基（以及经过化学修饰的碱基）通过纳米孔时会引起独特的电流变化。通过监测这些特征性电流信号，机器即可直接解码出RNA的序列信息，并同时识别碱基修饰。

 

2 核心优势

1. 无需逆转录与PCR扩增

DRS直接对天然RNA分子进行测序，避免了cDNA合成和PCR引入的偏好性与误差，数据更贴近真实生物学状态。

2. 全长转录本测序

直接获取从5’端到3′ poly(A)尾的完整RNA序列，无需拼接即可准确识别异构体、可变剪接事件和基因融合。

3. 同时检测RNA修饰

纳米孔信号可敏感反映碱基化学修饰（如m6A/m1A/m5C/m7G/hm5C/Ψ等），实现“一边测序列、一边测修饰”的多维组学分析。

4. 高分辨率poly(A)尾分析

直接读取poly(A)尾长度，结合异构体信息，精准研究 alternative polyadenylation (APA) 及其调控机制。

 

3 应用领域

1. 全长转录本鉴定：发现新基因、新异构体，尤其适用于复杂基因组物种（如多倍体、高杂合度植物）。

2. 可变剪接分析：精准解析剪接模式，识别组织或胁迫条件下的特异性剪接事件。

3. 融合转录本检测：识别基因间或基因与转座子间的融合事件，揭示基因组结构变异的功能影响。

4. poly(A)尾长度：直接测量poly(A)尾长度，研究其与mRNA稳定性、翻译效率的关系。

5. APA机制：直接检测不同 poly (A) 位点的选择，分析 APA 事件对基因表达的调控。

6. RNA修饰图谱构建：在全转录组范围内定位m⁶A、m⁵C等修饰位点，探索其调控功能。

 

直接RNA测序在植物领域创新发现

 

1 毛竹 (Moso Bamboo, Phyllostachys edulis)

● 转录本发现与注释提升：通过DRS技术，在毛竹中一次性鉴定了 22,360个 新型转录本，极大地完善和扩展了毛竹的转录组注释，为研究其快速生长机制提供了更全面的遗传信息基础。(Li et al., 2023)

● 可变多聚腺苷化（APA）的动态调控：研究发现，在毛竹笋的不同部位（基部和中部），基因倾向于使用不同的多聚腺苷化位点，这种全局性的APA位点转换可能与竹笋快速生长过程中的基因表达调控密切相关。(Li et al., 2023)

● m⁶A修饰的动态图谱：绘制了毛竹不同生长发育阶段的m⁶A修饰图谱，鉴定出多个在不同阶段被特异性甲基化的位点，揭示了RNA表观遗传修饰在毛竹生长中的潜在调控作用。(Li et al., 2023)

● 环状RNA的m⁶A修饰：首次发现毛竹中约有 11% 的环状RNA（circRNA）在其backsplice junction（反向剪接位点）附近发生m⁶A甲基化，这表明m⁶A可能作为一种重要的调控标记，参与了circRNA的生成或稳定性调控。(Wang et al., 2020)

● 环状RNA的鉴定与功能推测：通过改良的建库方法（环化反转录）结合DRS，成功鉴定出 470个 高可信度的circRNA。对其亲本基因的功能分析表明，这些circRNA可能参与染色体组织和分离等重要的细胞过程。(Wang et al., 2020)

 

2 拟南芥 (Arabidopsis thaliana)

● 揭示隐藏的转录组复杂性：即使在基因组注释最完善的模式植物中，DRS依然发现了 38,500个 新型转录本异构体和 8,700个 此前未知的独特剪接变体，颠覆了对拟南芥转录组复杂性的认知。(Parker et al., 2020; Zhang et al., 2020c)

● 精确解析关键基因的可变剪接：以开花关键调控基因 FLM 为例，DRS直接读取其全长，准确解析出19种剪接异构体，其中11种为的全新发现，这对于理解开花时间的精细调控至关重要。 (Parker et al., 2020)

● Poly(A)尾长度的组织特异性：首次在全转录组范围内直接测量了不同组织中的poly(A)尾长度，发现其分布具有显著的组织特异性（例如，花粉和种子中的poly(A)尾显著更长），为理解mRNA稳定性、翻译效率的组织特异性调控提供了新视角。 (Parker et al., 2020)

● m⁶A修饰的功能性验证：研究表明，当m⁶A位点被去甲基化后，转录本的3’末端加工会出现缺陷，导致其相对丰度下降，直接证明了m⁶A修饰在拟南芥mRNA成熟和稳定性维持中的关键功能。(Parker et al., 2020)

● 发现新型m⁶A写入器：鉴定出 FIOT1 (人类METTL16的同源蛋白) 是拟南芥中一种新的m⁶A甲基转移酶。FIOT1突变体表现出全局m⁶A水平下降和早花表型，将m⁶A修饰与植物开花时间调控直接联系起来。 (Xu et al., 2022)

● 转座子-基因嵌合转录本的广泛存在与功能：利用DRS长读长优势，精准鉴定了由约 3000个 基因位点产生的转座子-基因嵌合转录本，并发现转座子的插入位置（如3′ UTR）可以调控宿主基因在环境胁迫下的表达稳定性，揭示了转座子作为调控元件的重要作用。(Bertheller et al., 2023)

 

3 水稻 (Rice, Oryza sativa) &野生稻属 (Oryza spp.)

● 融合基因的进化研究：通过对多个稻属物种的比较分析，鉴定出 310个 融合转录本。计算其进化速率和固定频率，发现它们虽然起源频繁但固定下来的较少，受到了强烈的纯化选择，为“融合是新基因起源的重要机制”提供了有力的进化证据。(Zhou et al., 2022)

● m⁶A修饰的组织特异性图谱：构建了水稻6种不同组织的m⁶A修饰图谱，发现 276至2042个 转录本表现出明显的组织特异性m⁶A修饰模式，表明m⁶A可能参与了水稻组织分化和功能特化的调控。(Yu et al., 2023a)

● m⁵C修饰响应非生物胁迫：研究发现，在高盐胁迫条件下，发生m⁵C修饰的下调基因显著富集于抗逆反应通路，提示m⁵C修饰可能通过调控这些基因的表达参与水稻的盐胁迫应答。(Wu et al., 2024)

 

4 多倍体作物

油菜 (Brassica napus)：

● 多倍体剪接复杂性：成功比较了异源四倍体油菜与其二倍体亲本（甘蓝和甘蓝型油菜）之间复杂的可变剪接模式，为理解多倍化过程中转录组的重编程和适应性进化提供了重要线索。(Li et al., 2022)

悬铃木 (London Plane, Platanus x acerifolia)：

● 多倍化层级与剪接差异：在十二倍体悬铃木中，发现了 1,854个 与六倍体不同的可变剪接事件。这些十二倍体特有的转录本显著富集于DNA修复和重组调控通路，推测它们可能在维持更高倍性基因组的稳定性中发挥重要作用。(Yan et al., 2023)

 

5 林木

毛果杨 (Populus trichocarpa)：

● 干旱胁迫下的APA重编程：研究发现，在干旱胁迫下，毛果杨茎部木质部形成层细胞中，基因更倾向于使用远端poly(A)位点，导致产生更长3′ UTR的转录本，同时长poly(A)尾的转录本比例也显著增加，这可能是植物应对胁迫的一种转录后调控策略。(Gao et al., 2022)

● 胁迫响应中的表观转录组与蛋白质组联动：研究将DRS与蛋白质组学结合，发现干旱胁迫不仅引发了广泛的表观转录组（m⁶A） 变化，还导致了相应的蛋白质组重塑，揭示了从RNA修饰到蛋白质功能的胁迫响应链条。 (Gao et al., 2022)

松树 (Pine)：

● 养分胁迫下的m⁶A与APA耦合：在铵盐营养处理下，松树根中可变多聚腺苷化（APA）位点的使用变化与m⁶A沉积的增加显著相关，揭示了RNA修饰与3’末端加工在养分胁迫响应中的协同作用。(Ortigosa et al., 2022)

 

6 园艺作物

草莓 (Strawberry)：

● 果实发育中的转录组动态：在草莓果实发育和成熟过程中，发现了 110,888个 新型转录本，并精确刻画了白色果期是许多未报道转录本表达的关键转换期，为理解果实品质形成提供了新的分子基础。 (Chen et al., 2022)

柑橘 (Citrus spp.)：

● 跨物种比较转录组学：对9个柑橘物种进行DRS分析，不仅预测了数千个新转录本，还发现了 2,613-3,389个 新的lncRNA。首次在近缘物种间系统分析了同源基因间异构体数量的变异，为柑橘的进化与驯化研究提供了新资源。 (Hu et al., 2022)

卡那拉蓟 (Cynara cardunculus)：

● 基因模型校正与注释提升：利用DRS的长读长数据，对基于短读长序列组装的基因模型进行了大幅校正，共修正了 13,039个 基因模型，将完全组装的基因和转录本异构体的数量分别提升了 15% 和 18%，显著改善了该非模式植物的基因组注释质量。(Puglia et al., 2020)

 

7 禾谷类作物

小麦 (Wheat)：

● 种子发育早期的非编码RNA世界：研究发现，在小麦种子发育早期，表达了大量长链非编码RNA（lncRNA）和LTR逆转录转座子相关的转录本。共发现了 796个 新的lncRNA，且其中大量含有转座子衍生序列，揭示了转座子在塑造复杂基因组转录组中的活跃性。(Kirov et al., 2020)

玉米 (Maize)：

● m⁶A修饰调控翻译效率：通过整合DRS（检测m⁶A和APA）和多核糖体分析，发现m⁶A修饰富集于3’UTR region，并与使用远端APA位点正相关。更重要的是，发生m⁶A修饰的mRNA其翻译效率显著降低，揭示了m⁶A在玉米中作为一种翻译抑制标记的功能。 (Luo et al., 2020)

 

8 药用植物

喜树 (Camptotheca acuminata)：

● 喜树碱生物合成调控网络的完善：利用DRS数据，对喜树的转录组进行了大幅修正，校正了 4,746个 基因中的 5,692个 可变剪接事件。更重要的是，发现了 15个 可能调控抗癌药物喜树碱生物合成途径的新转录因子，为通过合成生物学手段提高喜树碱产量提供了新的候选调控靶点。(Zhang et al., 2023)


参考文献

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