可变剪接项目文章 | KPNA2 通过调节 YBX1 介导的 DDX3X 可变剪接促进骨肉瘤进展

瑞兴生物利用自主开发的SUVA可变剪接分析技术，为本研究提供了前期核心数据支撑：

✓ 差异剪接全景解析：基于GSE87624数据集（44例骨肉瘤样本），首次揭示骨肉瘤中alt5’ss为最高频事件。

✓ 精准锁定KPNA2：从2141个RBPs中筛选出71个差异表达RBPs，构建首个OS特异性RBP-AS共表达网络，锁定KPNA2为关键枢纽基因，YBX1为互作的剪接因子。TCGA生存分析证实KPNA2的预后价值。

瑞兴生物提供从RBP筛选到可变剪接分析的一站式解决方案，目前已成功应用于肿瘤、免疫、神经、发育、药物等多领域，加速科研成果转化，助力高水平期刊发表。

中文标题：KPNA2 通过调节 YBX1 介导的 DDX3X 可变剪接促进骨肉瘤进展

期刊：Oncogene

影响因子IF：7.3  Q1

发表时间：2025.7

DOI： 10.1038/s41388-025-03375-3

主要结果：

▪ 发现AS事件在OS中显著异常，尤其是5’剪接位点（alt5p）和3’剪接位点（alt3p）事件。

功能富集分析显示，差异AS事件与细胞周期、有丝分裂等生物学过程相关。

▪ 493个AS事件在原发性OS中特异性表达，174个在原发性与转移性OS中均显著。

分析GSE87624 mRNA-seq数据，构建RNA结合蛋白（RBPs）与AS事件的共表达网络。

主要结果：

▪ 鉴定出71个差异表达的RBPs（DERBPs），其中25个与106个AS事件显著共表达，涉及细胞周期、信号转导等通路。

▪ KPNA2、LEPR 等 DERBPs 在骨肉瘤中高表达，且与患者不良预后相关。

验证KPNA2在OS中的表达及其临床意义。

主要结果：

▪ KPNA2 在骨肉瘤细胞系（U2OS、MNNG/HOS 等）和临床组织中显著高表达，其高表达与患者总生存期缩短相关。

▪ 单细胞测序数据 GSE152048分析显示KPNA2在OS细胞中富集，且与增殖标志物Ki-67分布相似。

▪ IHC显示KPNA2在骨肉瘤组织中强阳性，而癌旁组织几乎不表达。

通过敲低/过表达KPNA2和YBX1，评估其对OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

主要结果：

▪ 结合前期RBP共表达网络分析结果，从差异表达的RNA结合蛋白（DERBP）中筛选出与可变剪接事件显著相关的YBX1（表达量最高且与KPNA2共表达）。

▪ KPNA2-YBX1功能轴验证：Co-IP证实KPNA2与YBX1存在直接相互作用，KPNA2敲低导致YBX1蛋白水平下降。

▪ 体外实验：KPNA2/YBX1敲低显著抑制OS细胞增殖、迁移和侵袭，而YBX1过表达可部分逆转KPNA2敲低的效应。

▪ 体内实验：KPNA2组和YBX1敲低均抑制肿瘤生长，YBX1过表达部分逆转KPNA2敲低的抑瘤效果。

研究KPNA2对YBX1亚细胞定位的影响。

主要结果：

▪ 免疫荧光和亚细胞分离实验证实，KPNA2 缺失导致 YBX1 滞留细胞质，过表达则增强其核定位。

▪ Western blot 显示 KPNA2 调控 YBX1 蛋白稳定性，影响其核内功能。

对两种骨肉瘤细胞系（U2OS和MNNG/HOS）的野生型与YBX1敲低组进行RNA-seq，分析YBX1敲低后的AS事件和基因表达变化。

主要结果：

▪ YBX1主要调控内含子保留（IR）事件。

▪ 差异基因富集于 RNA 剪接、细胞周期和无义介导衰变（NMD）通路，提示 YBX1 通过调控 AS 参与肿瘤进展。

▪ RT-PCR 直接验证受 YBX1 影响的 AS 事件，其中YBX1对DDX3X内含子17的调控最显著。

验证YBX1通过结合DDX3X内含子17调控其mRNA稳定性。

主要结果：

▪ YBX1直接结合DDX3X内含子17：YBX1 CLIP-seq数据识别DDX3X内含子17中的YBX1结合位点，RIP-qPCR显示YBX1抗体显著富集DDX3X内含子17区域。

▪ YBX1促进DDX3X内含子保留（IR）：YBX1敲低后，核RNA qRT-PCR显示内含子17保留水平降低，外显子连接效率增加。RNA-seq Sashimi图显示YBX1敲低导致内含子17覆盖度下降，外显子18连接增强。

▪ YBX1通过NMD途径降低DDX3X mRNA稳定性：NMD抑制剂NMDI14处理可部分逆转YBX1敲低导致的DDX3X mRNA降解。mRNA稳定性实验（Actinomycin D阻断转录）证实YBX1敲低延长DDX3X mRNA半衰期（t_1/2↑）。

▪ KPNA2/YBX1轴下调DDX3X蛋白表达：Western blot显示：YBX1敲低→DDX3X蛋白水平上升；YBX1过表达→DDX3X蛋白水平下降。

核心结论：KPNA2核转运YBX1 → YBX1结合DDX3X内含子17 → 促进内含子保留 → NMD途径降解mRNA → DDX3X蛋白水平下降 → 促进骨肉瘤进展

评估DDX3X在OS中的功能及其与YBX1的关系。

主要结果：

▪ 体外实验：DDX3X敲低促进OS细胞增殖、迁移、侵袭，而YBX1敲低可部分逆转DDX3X敲低的促癌效应。

▪ 体内实验：DDX3X敲低组促进肿瘤体积增加，而YBX1敲低部分逆转。

▪ Western blot检测验证DDX3X敲低导致细胞周期抑制蛋白p21下降、CDK2和AKT1表达增加，YBX1敲低可部分恢复这些蛋白的表达水平。

▪ YBX1→DDX3X↓→p21↓/CDK2↑/AKT1↑→细胞周期加速→肿瘤进展