已经有短读长转录组数据了，还有必要做全长吗？
看问题出在哪一层。如果差异在基因表达量层面，短读长足够，性价比也更高。如果关心的是 isoform 结构、剪接事件、APA 位点、融合基因，或者物种本身注释不全，短读长只能靠组装推测，全长测序给出的是实测结构。常见的做法是先跑短读长做定量和筛选，再对关键样本或关键基因补长读长定结构。
ONT-lrRNA-seq 和 ONT-DRS 怎么选？
两者读的都是全长，差别在于测的是 cDNA 还是 RNA 本身。lrRNA-seq 走逆转录 + PCR，产出稳定、所需 RNA 量少（≥2 µg），适合 isoform、剪接、APA、融合基因这类结构问题。DRS 不逆转录、不扩增，直接测天然 RNA 分子，能同时看到 RNA 碱基修饰（m6A 等）和 poly(A) 尾长度，代价是所需 RNA 量大得多（≥50 µg）。想看修饰，只能选 DRS。
能不能只寄提取好的 RNA？
可以，但不建议。RNA 在提取、分装、干冰运输环节里降解风险高，一旦 RIN 掉到 7 以下就要重新取样。寄组织或细胞，由我方在实验前统一提取质检，样本不合格可以当场发现，比寄到手里才发现降解要省时间。确实只能寄 RNA 时，请一并提供浓度、OD260/280 和电泳或 2100 的质检结果。
非模式物种、没有参考基因组能做吗？
能做，而且长读长在这类项目上优势最明显。没有参考基因组时可以用 de novo 方式直接从全长 reads 得到转录本集合，再做功能注释；有近缘物种基因组时也可以比对过去。请提前说明物种、倍性和组织类型，方便评估 RNA 提取难度（植物、真菌、高多糖高酚样本需要调整方案）。
RIN 达不到 7.0 怎么办？
先看是哪一类样本。部分特殊物种本来就没有明显的 28S 条带，RIN 算法会失真，这种情况以 Agilent 2100 的基线是否平整为准。真降解的样本建议重新取样，不要勉强上机——长读长对完整性更敏感，降解样本会直接表现为 reads 变短、全长比例下降，数据用不上。
需要多少生物学重复？
做差异表达分析建议每组至少 3 个生物学重复，和短读长的要求一致。只是做转录本结构普查、完善基因注释的话，1–2 个样本也能出结果，但结论只能描述"存在哪些 isoform"，不能做组间统计推断。
项目周期多久？
样本与 RNA 质检合格后，建库测序约 3–4 周，标准分析约 2 周。融合基因验证、与短读长数据联合分析、可变剪接与预后关联等高级分析按需求另行约定。
